在前期“濾”見新知系列課堂中，我們系統(tǒng)梳理了除菌濾器的驗證概念及驗證主計劃，本期將聚焦驗證體系中的核心環(huán)節(jié)——細菌截留測試。細菌截留是過濾系統(tǒng)驗證的關(guān)鍵部分，旨在確保除菌級過濾器在藥品生產(chǎn)過程中的性能，通過此測試，可以有效管理風險并保證合規(guī)性。特別是在最終無菌過濾步驟中，細菌截留測試確保過濾器在惡劣條件下仍能有效工作，從而保護產(chǎn)品質(zhì)量，滿足監(jiān)管要求。測試流程從初步確認細菌生存性開始，逐步評估細菌截留，并在最不利條件下評估過濾影響。最終，根據(jù)測試結(jié)果和過程參數(shù)，確認過濾器在制造商的工藝條件下能生成無菌濾出液。

本文主要探討細菌截留實驗的法規(guī)要求和實施策略，也會討論實驗前的準備工作，如調(diào)整工藝條件和挑戰(zhàn)微生物以確保實驗的有效性。重點介紹細菌截留驗證的關(guān)鍵點，涉及濾膜測試、過濾前后考量、接收標準和調(diào)查程序。最后，概述法規(guī)指南近兩年對細菌截留現(xiàn)場核查的關(guān)注焦點，包括微生物存活、膜片選擇、滅菌模擬、壓差和動態(tài)時間模擬，以及挑戰(zhàn)水平的法規(guī)符合性。本摘要旨在為細菌截留實驗提供深入理解及實踐指導。

細菌截留實驗法規(guī)及驗證策略

在細菌截留實驗中，驗證策略需模擬實際工藝的最差條件，以證明除菌過濾器能在高濃度下產(chǎn)生無菌液體。實驗包含生存性確認、回收率確認和過濾器截留能力確認。

根據(jù)GMP指南，實驗前需確認微生物在工藝條件下的生存性，若受影響，可通過調(diào)整工藝條件、配方、挑戰(zhàn)時間或更換微生物來解決。

細菌截留驗證法規(guī)核心要點

通過實驗室模擬工藝最差條件，證明除菌過濾器在10⁷CFU/cm²挑戰(zhàn)下產(chǎn)出無菌液體。驗證包含三大模塊：

·生存性確認——確保微生物在藥液中存活

·回收率確認——驗證培養(yǎng)方法可靠性

·截留能力確認——實測過濾器除菌性能

為何必須做生存性確認？

“應盡可能將挑戰(zhàn)微生物直接接種在藥品中進行細菌挑戰(zhàn)。但是藥品和/或工藝條件本身可能會影響挑戰(zhàn)微生物的存活力，因此在進行細菌截留實驗之前，需要確認挑戰(zhàn)微生物于工藝條件下在藥品中的存活情況，以確定合理的細菌挑戰(zhàn)方法，也即活度實驗(生存性實驗)”--- 《除菌過濾技術(shù)及應用指南》，NMPA, 2018年10月

當前液體無菌性的確認普遍采用微生物培養(yǎng)法，若待測液體自身具備抑菌或殺菌特性，其培養(yǎng)結(jié)果的有效性將無法確認，可能無法真實反映樣本的無菌狀態(tài)。因此，在啟動正式驗證前，必須開展微生物生存性確認，以確證目標微生物在該特定料液中能否存活并進行有效培養(yǎng)。

總結(jié)：若藥液含抑菌/殺菌成分，將導致培養(yǎng)結(jié)果失效。提前確認微生物存活狀態(tài)，是驗證有效性的前提。

除菌過濾工藝驗證策略決策樹

來源：2023版GMP指南

從GMP指南決策樹里我們可以看出在細菌截留試驗前必須驗證挑戰(zhàn)微生物在目標產(chǎn)品和工藝條件下的生存性：若微生物可存活，則直接將其接種于產(chǎn)品中進行挑戰(zhàn)試驗；若無法存活，需使用該產(chǎn)品預處理待測過濾器（核心方法），隨后采用經(jīng)充分驗證的替代溶液實施微生物挑戰(zhàn)。

替代方案下進行微生物挑戰(zhàn)實驗有如下幾種建議可參考：

a.調(diào)整工藝參數(shù)：修改（如降低）溫度以適應微生物生存。

b.調(diào)整料液配方：改變pH或去除抑菌/殺菌成分（需評估并確保不影響產(chǎn)品關(guān)鍵屬性或過濾器兼容性）。

c.限定挑戰(zhàn)時間段：在微生物可存活的特定時間段內(nèi)進行加菌挑戰(zhàn)。

d.更換挑戰(zhàn)微生物：選用從制劑中或環(huán)境監(jiān)控分離、更能耐受產(chǎn)品或工藝的微生物。

細菌截留實驗設(shè)計及方法

了解細菌截留的驗證策略后，我們再來展開實驗設(shè)計。細菌截留驗證前需進行生存性和回收率實驗，以確定挑戰(zhàn)微生物在特定接觸時長和溫度條件下的LRV值（對數(shù)下降值）。如果LRV值≤1，微生物可存活于藥液中，可采用直接方法進行過濾；若LRV值＞1，藥液可能對微生物有抑制或殺菌作用，需采用模擬最差工藝條件的不加菌藥液進行工藝模擬，并通過調(diào)整溫度、pH值或沖洗系統(tǒng)以去除抑菌物質(zhì)后再進行加菌挑戰(zhàn)。

細菌截留試驗裝置示意圖

細菌截留試驗最差條件的考量

細菌截留試驗的研究目的是模擬實際生產(chǎn)過濾工藝中的最差條件，過濾含有一定量挑戰(zhàn)微生物的產(chǎn)品溶液或者產(chǎn)品替代溶液，以確認除菌過濾器的微生物截留能力。--- 《除菌過濾技術(shù)及應用指南》，NMPA, 2018年10月

在細菌截留實驗設(shè)計中，需基于驗證所需的最差條件原則，從四個維度論證關(guān)鍵參數(shù)：

a.藥液性質(zhì)：滲透壓（高滲透壓可能導致微生物收縮而提高穿透風險）、表面張力及離子強度等物理化學屬性，需識別對截留效率影響最顯著的條件。
b.工藝參數(shù)：操作壓力、流速、時間、溫度波動、液體壓力、過濾方式及PUPSIT（使用前滅菌后完整性）等操作變量，應確認這些工藝的最差參數(shù)條件。
c.過濾器特性：選擇低泡點濾膜作為挑戰(zhàn)單元，并確?；厥諡V膜的微生物可培養(yǎng)性。
d.挑戰(zhàn)微生物：采用缺陷短波假單胞菌（Brevundimonas diminuta）時，需通過標準化培養(yǎng)控制菌體形態(tài)及活性，使其穿透風險表征最差工藝條件。

細菌截留驗證實施要點總結(jié)

法規(guī)指南對細菌截留現(xiàn)場核查要點

近兩年法規(guī)機構(gòu)對細菌截留現(xiàn)場核查的重點包括微生物生存性、低泡點膜片選擇、滅菌程序的模擬、壓差正確模擬、動態(tài)過濾時間模擬以及挑戰(zhàn)水平是否滿足法規(guī)要求。這些要點確保驗證結(jié)果的真實性和有效性，避免因條件選擇不當導致的法規(guī)不接受情況。

總結(jié) 

細菌截留實驗在除菌過濾驗證中有著關(guān)鍵作用，旨在通過模擬最惡劣條件來測試除菌過濾器的效能。本文闡述了驗證過程中的三個核心步驟：確認微生物的生存性、回收率的確認，以及驗證過濾器的截留能力。在實驗啟動前需準確評估微生物生存性的必要性，以及一系列策略，包括工藝的調(diào)整、配方的修改及選擇合適的微生物，以確保實驗的有效性和準確性。此外，我們還深入討論了實驗設(shè)計的考量因素，如濾膜的選擇、液體類型以及壓差控制等關(guān)鍵參數(shù)，旨在為濾器使用者提供一份全面且實用的細菌截留實驗執(zhí)行指南。

此外，艾里奧斯還提供設(shè)計和驗證過濾系統(tǒng)的服務，旨在降低風險并滿足行業(yè)標準，支持法規(guī)申報的數(shù)據(jù)包可靠性。這一系列服務和測試確保了藥品制造過程中的無菌環(huán)境，符合法規(guī)和質(zhì)量標準。

參考法規(guī)與指南

[1] 《藥品GMP指南》（2023年修訂）無菌制劑-上冊；

[2] PDA Technical Report No.26 ，Revised 2008，Sterilizing Filtration of Liquids；

[3] EU Guidelines to Good Manufacturing Practice，Annex 1 Manufacture of Sterile Medicinal Products，2022；

[4] 《除菌過濾技術(shù)及應用指南》（國家藥品監(jiān)督管理局2018年第85號）。