在前期“濾”見(jiàn)新知系列課堂中，我們系統(tǒng)梳理了除菌濾器的驗(yàn)證概念及驗(yàn)證主計(jì)劃，本期將聚焦驗(yàn)證體系中的核心環(huán)節(jié)——細(xì)菌截留測(cè)試。細(xì)菌截留是過(guò)濾系統(tǒng)驗(yàn)證的關(guān)鍵部分，旨在確保除菌級(jí)過(guò)濾器在藥品生產(chǎn)過(guò)程中的性能，通過(guò)此測(cè)試，可以有效管理風(fēng)險(xiǎn)并保證合規(guī)性。特別是在最終無(wú)菌過(guò)濾步驟中，細(xì)菌截留測(cè)試確保過(guò)濾器在惡劣條件下仍能有效工作，從而保護(hù)產(chǎn)品質(zhì)量，滿足監(jiān)管要求。測(cè)試流程從初步確認(rèn)細(xì)菌生存性開(kāi)始，逐步評(píng)估細(xì)菌截留，并在最不利條件下評(píng)估過(guò)濾影響。最終，根據(jù)測(cè)試結(jié)果和過(guò)程參數(shù)，確認(rèn)過(guò)濾器在制造商的工藝條件下能生成無(wú)菌濾出液。

本文主要探討細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)的法規(guī)要求和實(shí)施策略，也會(huì)討論實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作，如調(diào)整工藝條件和挑戰(zhàn)微生物以確保實(shí)驗(yàn)的有效性。重點(diǎn)介紹細(xì)菌截留驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)，涉及濾膜測(cè)試、過(guò)濾前后考量、接收標(biāo)準(zhǔn)和調(diào)查程序。最后，概述法規(guī)指南近兩年對(duì)細(xì)菌截留現(xiàn)場(chǎng)核查的關(guān)注焦點(diǎn)，包括微生物存活、膜片選擇、滅菌模擬、壓差和動(dòng)態(tài)時(shí)間模擬，以及挑戰(zhàn)水平的法規(guī)符合性。本摘要旨在為細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)提供深入理解及實(shí)踐指導(dǎo)。

細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)法規(guī)及驗(yàn)證策略

在細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證策略需模擬實(shí)際工藝的最差條件，以證明除菌過(guò)濾器能在高濃度下產(chǎn)生無(wú)菌液體。實(shí)驗(yàn)包含生存性確認(rèn)、回收率確認(rèn)和過(guò)濾器截留能力確認(rèn)。

根據(jù)GMP指南，實(shí)驗(yàn)前需確認(rèn)微生物在工藝條件下的生存性，若受影響，可通過(guò)調(diào)整工藝條件、配方、挑戰(zhàn)時(shí)間或更換微生物來(lái)解決。

細(xì)菌截留驗(yàn)證法規(guī)核心要點(diǎn)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室模擬工藝最差條件，證明除菌過(guò)濾器在10⁷CFU/cm²挑戰(zhàn)下產(chǎn)出無(wú)菌液體。驗(yàn)證包含三大模塊：

·生存性確認(rèn)——確保微生物在藥液中存活

·回收率確認(rèn)——驗(yàn)證培養(yǎng)方法可靠性

·截留能力確認(rèn)——實(shí)測(cè)過(guò)濾器除菌性能

為何必須做生存性確認(rèn)？

“應(yīng)盡可能將挑戰(zhàn)微生物直接接種在藥品中進(jìn)行細(xì)菌挑戰(zhàn)。但是藥品和/或工藝條件本身可能會(huì)影響挑戰(zhàn)微生物的存活力，因此在進(jìn)行細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)之前，需要確認(rèn)挑戰(zhàn)微生物于工藝條件下在藥品中的存活情況，以確定合理的細(xì)菌挑戰(zhàn)方法，也即活度實(shí)驗(yàn)(生存性實(shí)驗(yàn))”--- 《除菌過(guò)濾技術(shù)及應(yīng)用指南》，NMPA, 2018年10月

當(dāng)前液體無(wú)菌性的確認(rèn)普遍采用微生物培養(yǎng)法，若待測(cè)液體自身具備抑菌或殺菌特性，其培養(yǎng)結(jié)果的有效性將無(wú)法確認(rèn)，可能無(wú)法真實(shí)反映樣本的無(wú)菌狀態(tài)。因此，在啟動(dòng)正式驗(yàn)證前，必須開(kāi)展微生物生存性確認(rèn)，以確證目標(biāo)微生物在該特定料液中能否存活并進(jìn)行有效培養(yǎng)。

總結(jié)：若藥液含抑菌/殺菌成分，將導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果失效。提前確認(rèn)微生物存活狀態(tài)，是驗(yàn)證有效性的前提。

除菌過(guò)濾工藝驗(yàn)證策略決策樹(shù)

來(lái)源：2023版GMP指南

從GMP指南決策樹(shù)里我們可以看出在細(xì)菌截留試驗(yàn)前必須驗(yàn)證挑戰(zhàn)微生物在目標(biāo)產(chǎn)品和工藝條件下的生存性：若微生物可存活，則直接將其接種于產(chǎn)品中進(jìn)行挑戰(zhàn)試驗(yàn)；若無(wú)法存活，需使用該產(chǎn)品預(yù)處理待測(cè)過(guò)濾器（核心方法），隨后采用經(jīng)充分驗(yàn)證的替代溶液實(shí)施微生物挑戰(zhàn)。

替代方案下進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)有如下幾種建議可參考：

a.調(diào)整工藝參數(shù)：修改（如降低）溫度以適應(yīng)微生物生存。

b.調(diào)整料液配方：改變pH或去除抑菌/殺菌成分（需評(píng)估并確保不影響產(chǎn)品關(guān)鍵屬性或過(guò)濾器兼容性）。

c.限定挑戰(zhàn)時(shí)間段：在微生物可存活的特定時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行加菌挑戰(zhàn)。

d.更換挑戰(zhàn)微生物：選用從制劑中或環(huán)境監(jiān)控分離、更能耐受產(chǎn)品或工藝的微生物。

細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

了解細(xì)菌截留的驗(yàn)證策略后，我們?cè)賮?lái)展開(kāi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。細(xì)菌截留驗(yàn)證前需進(jìn)行生存性和回收率實(shí)驗(yàn)，以確定挑戰(zhàn)微生物在特定接觸時(shí)長(zhǎng)和溫度條件下的LRV值（對(duì)數(shù)下降值）。如果LRV值≤1，微生物可存活于藥液中，可采用直接方法進(jìn)行過(guò)濾；若LRV值＞1，藥液可能對(duì)微生物有抑制或殺菌作用，需采用模擬最差工藝條件的不加菌藥液進(jìn)行工藝模擬，并通過(guò)調(diào)整溫度、pH值或沖洗系統(tǒng)以去除抑菌物質(zhì)后再進(jìn)行加菌挑戰(zhàn)。

細(xì)菌截留試驗(yàn)裝置示意圖

細(xì)菌截留試驗(yàn)最差條件的考量

細(xì)菌截留試驗(yàn)的研究目的是模擬實(shí)際生產(chǎn)過(guò)濾工藝中的最差條件，過(guò)濾含有一定量挑戰(zhàn)微生物的產(chǎn)品溶液或者產(chǎn)品替代溶液，以確認(rèn)除菌過(guò)濾器的微生物截留能力。--- 《除菌過(guò)濾技術(shù)及應(yīng)用指南》，NMPA, 2018年10月

在細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，需基于驗(yàn)證所需的最差條件原則，從四個(gè)維度論證關(guān)鍵參數(shù)：

a.藥液性質(zhì)：滲透壓（高滲透壓可能導(dǎo)致微生物收縮而提高穿透風(fēng)險(xiǎn)）、表面張力及離子強(qiáng)度等物理化學(xué)屬性，需識(shí)別對(duì)截留效率影響最顯著的條件。
b.工藝參數(shù)：操作壓力、流速、時(shí)間、溫度波動(dòng)、液體壓力、過(guò)濾方式及PUPSIT（使用前滅菌后完整性）等操作變量，應(yīng)確認(rèn)這些工藝的最差參數(shù)條件。
c.過(guò)濾器特性：選擇低泡點(diǎn)濾膜作為挑戰(zhàn)單元，并確保回收濾膜的微生物可培養(yǎng)性。
d.挑戰(zhàn)微生物：采用缺陷短波假單胞菌（Brevundimonas diminuta）時(shí)，需通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)控制菌體形態(tài)及活性，使其穿透風(fēng)險(xiǎn)表征最差工藝條件。

細(xì)菌截留驗(yàn)證實(shí)施要點(diǎn)總結(jié)

法規(guī)指南對(duì)細(xì)菌截留現(xiàn)場(chǎng)核查要點(diǎn)

近兩年法規(guī)機(jī)構(gòu)對(duì)細(xì)菌截留現(xiàn)場(chǎng)核查的重點(diǎn)包括微生物生存性、低泡點(diǎn)膜片選擇、滅菌程序的模擬、壓差正確模擬、動(dòng)態(tài)過(guò)濾時(shí)間模擬以及挑戰(zhàn)水平是否滿足法規(guī)要求。這些要點(diǎn)確保驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性和有效性，避免因條件選擇不當(dāng)導(dǎo)致的法規(guī)不接受情況。

總結(jié) 

細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)在除菌過(guò)濾驗(yàn)證中有著關(guān)鍵作用，旨在通過(guò)模擬最惡劣條件來(lái)測(cè)試除菌過(guò)濾器的效能。本文闡述了驗(yàn)證過(guò)程中的三個(gè)核心步驟：確認(rèn)微生物的生存性、回收率的確認(rèn)，以及驗(yàn)證過(guò)濾器的截留能力。在實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)前需準(zhǔn)確評(píng)估微生物生存性的必要性，以及一系列策略，包括工藝的調(diào)整、配方的修改及選擇合適的微生物，以確保實(shí)驗(yàn)的有效性和準(zhǔn)確性。此外，我們還深入討論了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的考量因素，如濾膜的選擇、液體類型以及壓差控制等關(guān)鍵參數(shù)，旨在為濾器使用者提供一份全面且實(shí)用的細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)執(zhí)行指南。

此外，艾里奧斯還提供設(shè)計(jì)和驗(yàn)證過(guò)濾系統(tǒng)的服務(wù)，旨在降低風(fēng)險(xiǎn)并滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，支持法規(guī)申報(bào)的數(shù)據(jù)包可靠性。這一系列服務(wù)和測(cè)試確保了藥品制造過(guò)程中的無(wú)菌環(huán)境，符合法規(guī)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

參考法規(guī)與指南

[1] 《藥品GMP指南》（2023年修訂）無(wú)菌制劑-上冊(cè)；

[2] PDA Technical Report No.26 ，Revised 2008，Sterilizing Filtration of Liquids；

[3] EU Guidelines to Good Manufacturing Practice，Annex 1 Manufacture of Sterile Medicinal Products，2022；

[4] 《除菌過(guò)濾技術(shù)及應(yīng)用指南》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2018年第85號(hào)）。